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應用研究
關于細菌內毒素檢查法中幾個問題的探索
Date: 2017-07-18 14:26:41

    本文是通過與客戶的交流以及客戶咨詢的相關問題,進行一次歸納總結。通過工作中出現的問題有必要對以下三種情況進行交流,以加強對細菌內毒素檢查法的正確理解,同時糾正一些錯誤的觀念。
    ·如何全面理解細菌內毒素檢查法中污染物對試驗結果的影響?
    ·如何正確認識器皿洗滌的重要性?
    ·如何正確理解鱟試劑的抗干擾能力和鱟試劑的特異性?
    許多客戶對污染的認識是不全面或錯誤的,他們認為在細菌內毒素檢查過程中,器皿被污染的結果必然導致陽性結果的出現,但試驗結果正好與他們的認識有時正好相反,可能陽性對照全為陰性,對此亦有百思不得其解。要正確理解這個問題,首先要正確理解鱟試劑與內毒素的反應機理,鱟試劑與內毒素的反應為一系列酶反應,生物酶反應受許多因素的干擾。在日常工作中,我們要特別注意一些因素對試驗結果的影響,如PH值、器皿的潔凈度以及環境因素等。
1   鱟試劑與內毒素的反應機理
    1、PH值:鱟試劑生物活性在pH 6-8時酶活性穩定;pH ≤3 或≥10時,酶活性受到抑制。故鱟試驗時,供試品 pH 最好應預調和6.88.0 為好,必要時可用無內毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液調節 pH 值。
    2、器皿: 內毒素稀釋不宜用注射器,而應用經過校正的刻度玻璃吸管。因為注射器刻度準確度差,而且針栓壁磨沙面易吸附內毒素,試驗誤差大。同時要特別注意注射器針頭引入的鐵離子對試驗結果的干擾,鐵離子對鱟試驗反應有較強的抑制作用。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干擾試驗結果,故宜慎用。
    3、金屬陽離子: 離子對細菌內毒素測定結果影響較大,一方面陽離子如Fe3+、Al3+強度較大會引起內毒素的聚集造成內毒素局部濃度過高,同時還必須注意高價陽離子(如Fe3+)對鱟試劑酶反應具有強抑制作用;另一方面鱟試劑必須在二價陽離子Ca2+、Mg2+的參與下才能被激活形成凝膠反應。許多藥物因PH值≥10時,其中的陰離子會吸收鱟試劑中的 Ca2+、Mg2+離子,使實驗呈假陰性。
    4、其它物質:如血液中的凝血因子、絡合劑、抗凝劑等,都可能干擾鱟試劑與內毒素的反應,同時消毒劑和有機溶劑對鱟試驗都有抑制作用。
一、器皿洗滌的重要性

    《中國生物制品操作規程》389頁——細菌內毒素檢查法“玻璃器皿的洗滌”規定:“  將被洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來水洗凈并烘干水分后,置洗液中浸泡4小時,取出將洗液瀝干,用自來水將殘余的洗液洗凈,再用新鮮蒸餾水沖洗干燥(禁用超純水或久置的蒸餾水沖洗)后置適宜的密閉金屬容器中,迅速置烤箱中,除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內毒素。”應該特別注意,該規程明確規定最后沖洗玻璃器皿必須“用新鮮蒸餾水沖洗,禁用純化水和久置的蒸餾水沖洗。”有的客戶使用反滲透制備的純化水沖洗試驗用玻璃器皿,結果試驗中所有的陽性對照都為陰性,復核鱟試劑靈敏度時試驗結果誤差較大,這主要是由于純化水和蒸餾水的內在質量不同所造成的。因純化水中存在的陰陽離子經250℃高溫干烤不能完全被破壞,這時不同的離子就產生對鱟試劑酶反應抑制或增強的反應,為了保證試驗結果的準確性和檢驗報告的權威性,我們應該嚴格遵守操作規程,用新鮮多效蒸餾水沖洗鱟試驗用玻璃器皿。
二、抗干擾能力和鱟試劑的特異性
    有客戶在做白蛋白的干擾試驗時使用兩個廠家的鱟試劑,干擾試驗結果其中一個廠家的鱟試劑需要稀釋4倍而另一個廠家的鱟試劑需要稀釋8倍才能排除干擾。據此向我們咨詢是否稀釋倍數小的鱟試劑抗干擾能力強?而稀釋倍數大的鱟試劑抗干擾能力就差?我們認為對一些粘度較大的產品白蛋白、醫用透明質酸鈉,建議使用8倍或16倍稀釋來建立內毒素常規檢查規程(SOP),因為鱟試驗是一種復雜的酶反應,任何一種藥品、生物制品的濃度或粘度對試驗結果皆有影響,是抑制還是增強反應仍需做具體的分析。單純以干擾試驗的稀釋倍數來判斷鱟試劑的質量是片面的。
如何判斷鱟試劑抗干擾能力,必須從幾個方面進行分析:
    1、鱟試劑靈敏度的差異  不同廠家的鱟試劑雖然標示值(λ)相同,但仍然存在較大的誤差。比如,標示值為0.5EU/ml的鱟試劑,若有的產品真實靈敏度可能是0.75EU/ml或1.0EU/ml;而另一個廠家的鱟試劑可能是0.35EU/ml或0.25EU/ml時,按0.52λ誤差標準都是合格產品,但對同一檢品雖然在相同的稀釋倍數下,這兩個廠家的鱟試劑產品對內毒素的檢出水平卻不同。
    2、鱟試劑與內毒素脂多糖反應的差異  在正常的藥品、生物制品生產時,因不同時期的原料來源和水源的因素,都可能導致半成品或成品污染的菌株不同,而導致內毒素脂多糖物質與鱟試劑反應的活性不同。有的鱟試劑對革蘭氏陰性菌或各種微生物產生的內毒素脂多糖均有敏感性,有的鱟試劑可能只對革蘭氏陰性菌產生的內毒素敏感而對其它微生物產生的內毒素脂多糖不敏感,故同一檢品雖然在相同稀釋倍數下,兩個廠家的鱟試劑對內毒素的檢出能力亦不同。
    3、PH值的影響  鱟試劑生產用水質量和BET水PH值的差異,可影響鱟試劑對內毒素脂多糖反應敏感性。有的鱟試劑生產公司(或廠)的原料用水不是多效蒸餾水,而是利用一般純化水,而且PH值都在6.0以下。而鱟試劑的酶反應最佳PH值為6.88.0,所以一直以來美國、英國藥典和日本藥局方規定檢品必須調節PH值6.08.0。
    近幾年來,鱟試劑特異性差所造成的后果比較隱蔽,不易被使用者所發現,但是這種危害性往往以人的生命為代價所表現出來?!斗稍诰€》報道:2000年5月4日晚10時,8歲女童何某某因扁桃體發炎,被父親帶到河南省某中心醫院就診。醫院為她所用的藥物為青霉素,所用液體是該醫院自己生產的250ml袋裝生理鹽水(批號20000427)。輸液約20分鐘后,何某某開始出現胸悶、全身顫抖等癥狀。6小時后,經搶救無效死亡。2000年5月8日,該醫院將何一一使用的該院自制氯化鈉注射液樣品送往省質量檢驗部門檢驗,檢驗結果是:細菌內毒素不符合規定。經醫療事故技術鑒定委員會鑒定,“患兒何某某因輸入細菌內毒素超標的液體引起輸液反應,輸液反應導致主要臟器缺血缺氧,功能衰竭死亡”(豫醫鑒〖2001〗10號),這是一起嚴重的由于內毒素漏檢所造成的悲劇。用我廠生產的海浪牌鱟試劑來檢驗該批生理鹽水,同樣檢測出該藥品注射液內毒素不合格。同樣的事故還發生在吉林省公主嶺地區某制藥廠和河北邯鄲某制藥廠,他們分別使用某企業的鱟試劑都沒有檢驗出。產品中的內毒素而造成產品漏檢,造成臨床大面積嚴重的輸液反應,這種情況都是鱟試劑特異性差的一種表現。對內毒素不合格的藥品,便威脅到人民群眾的生命安全。
    鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準確測出被測物質內毒素的能力,既不能造成樣品內毒素的漏檢,也不能將其它物質錯判為內毒素。目前我廠研究證明,已知能與鱟試劑發生反應的物質有細菌內毒素和β-葡聚糖,而內毒素反應曲線為S型特征曲線,β-葡聚糖反應曲線為經過0點的斜線。
    鱟試劑的特異性(專屬性)差的另一種表現,是將其它物質(如β-葡聚糖)判定為內毒素,錯誤將合格藥品判為不合格,造成制藥廠直接經濟損失。
    通過以上幾個方面的分析,干擾試驗結果時稀釋幾倍能排除干擾并不重要,而對內毒素的檢出能力(鱟試劑的特異性)才是最關鍵的,也是判定鱟試劑質量的唯一標準。
三、污染的全面理解

    通過以上幾個方面的分析,我們應認識到內毒素的污染只是其中之一,污染物的種類很多,影響情況也很復雜,比如樣品中的藥品及其它成分影響了樣品的PH值、鱟試劑的特異性、內毒素的活性等。這些污染物可能對鱟試劑與內毒素反應產生增強和抑制作用,其中以抑制作用為主。試驗環境(檢驗室空氣潔凈度、溫度和濕度等)和操作程序都可能引起試驗結果的差異,應引起大家的注意。

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